凝集素芯片—儿童非细菌性肺炎潜在血清学生物标志物的发现

        儿童肺炎可由多种微生物引起，如病毒、细菌、支原体和衣原体，而由不同病因引起的肺炎则有不同的治疗策略。近年来支原体肺炎的发病率逐渐增加，但临床医生由于缺乏足够的诊断方法，不能有效区分细菌性肺炎和非细菌性肺炎，从而无法对症下药，全球每年约有200万五岁以下儿童死于肺炎。因此，寻求鉴定新的生物标志物，用于非细菌性肺炎和细菌性肺炎之间的鉴别诊断是必不可少的。

        博翀生物的合作伙伴（华盈生物）张庆华博士团队领衔，以社区获得性肺炎（CAP）为研究对象，通过使用凝集素芯片，结合质谱，分析不同病因引起肺炎的儿童患者的血清样品，并通过 Western blot 分析评估，最终找到儿童非细菌性肺炎血清诊断的潜在生物标志物 HPR，该研究成果近期在《Proteomics-Clinical Applications》杂志上发表。

         思路解析

        1）儿童血清样本收集；

        2）凝集素芯片筛选血清样本确定候选标志物；

        3）Lectin blot 分析验证芯片结果；

        4）Pull down 和 LC-MS/MS 进行验证；

        5）Western blot 分析确定潜在标志物。

         研究结果

        1）样本收集

        该研究中的所有受试者均为在上海儿童医学中心接受社区获得性肺炎（CAP）住院治疗的儿童，采集血清样本并且将样品储存在-80℃直至使用。对于凝集素芯片筛选，支原体肺炎组、细菌性肺炎组和正常儿童各设组6组；进一步的 Western blot 验证实验中，细菌性肺炎、支原体肺炎和正常组各设置21组，病毒性肺炎设置19组。所有样品信息如表1所示。

        2）凝集素芯片筛选血清样本确定候选标志物

        研究人员利用凝集素芯片对支原体肺炎患儿（n=6），细菌性肺炎患儿（n =6）和正常儿童（n=6）的血清样品进行分析。有4种凝集素（CALSEPA、MIA、PAA、SNA-I）在不同组间的结合信号有明显差异。

         3）Lectin blot分析验证芯片结果

        研究人员选取 SNA-I 进行 lectin blot 实验，对芯片筛选结果进行验证。如图2 A 所示，支原体肺炎组检测信号明显高于正常对照组和细菌性肺炎组；对考马斯蓝染色的42 kDa 条带附近进行信号强度分析，如图2 B 所示，支原体肺炎组 SNA-I 的分子量在42 kDa 附近强烈增加，而且其含量与结合信号具有高度相关性。据此，研究人员推测，支原体肺炎患儿中 SNA-I 的结合信号增加可能是由于42 kDa 附近蛋白的表达量升高。

         4）Pull down、LC-MS/MS 和 Western blot 确定潜在标志物

        通过凝集素印迹分析，接近42 kDa 的条带是考马斯亮蓝染色最多的条带，这表明蛋白质与 SNA-I 有强烈的相互作用。切下该条带用于LC-MS/ MS鉴定，获得了18种潜在的 SNA-I 结合糖蛋白，其中两种高度同源的蛋白质（高达91％的相似性）HP 和 HPR 含量最多。

        为了进一步分析潜在的生物标志物，研究人员对来自 SNA-I 样品的两种蛋白质进行了 Western blot 分析，发现 M 组在42 kDa 左右的蛋白是 HPR。随后进行大样本的血清验证，细菌性肺炎、支原体肺炎和正常组各设置21组，病毒性肺炎设置19组。相对定量结果显示，与细菌性肺炎组相比 HPR 在支原体肺炎组和病毒性肺炎组中均升高。与正常组相比，所有肺炎组的 HPR 均升高。证实了支原体肺炎患儿中 SNA-I 的结合信号增加是由于 HPR 的表达升高。